1-8 Vibrio Cholerae17
1-8-1 شناسایی و طبقه بندی18
1-8-2 فیزیولوژی19
1-8-3 عوامل موثر در بیماری زایی19
1-8-4 تأیید بیوشیمیایی19
1-8-4-1واکنش بر روی محیط TS یا KIA20
1-8-4-2 تستهای دکربوکسیلاز- دهیدرولاز20
1-8-4-3 تست نیاز به نمک برای رشد20
1-8-4-4 حساسیت به ترکیب ویبریواستاتیک 129/O20
1-9 رشد و نمو باکتریها20
1-10 زمان تقسیم سلولی21
1-11 مراحل رشد و منحنی رشد باکتریها21
1-12 منحنی رشد باکتریایی21
1-12-1 مرحلهی خفته یا تاخیری (Lag phase)22
1-12-2 مرحله ی فعال تکثیر یا رشد و تکثیر لگاریتمی (Logphase)22
1-12-3 مرحله ی سکون یا تکثیر کند (Stationary phase)22
1-12-4 مرحله ی زوال یا مرگ (Deathphase)23
1-13سرعت رشد و زمان نسل23
1- 14 محاسبه زمان نسل باکتری23
1-15 شیوه های سنجش تعداد سلول24

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

1-16 محیطهای کشت25
1-16-1محیط کشت مایع25
1-16-2 محیط کشت جامد25
1-17اهداف کلی25
1-18 اهداف اختصاصی25
1-19 پرسشهای تحقیق26
1-20فرضیه های تحقیق26
فصل دوم: سابقه و پیشینه
2-1 تاریخچه ترانسفورماسیون28
2-2 سیستم نوترکیبی مبتنی بر?-Red29
2-3 پلاسمید PKD4630
فصل سوم: مواد و روش ها
3-1 دستگاه‌ها32
3-2 موادشیمیایی32
3-3 کیتها32
3-4 میکروارگانیسم‌ها32
3-5 کشت سویه انتخابی32
3-6 Transformation33
3-7 تهیه منحنی لگاریتمی34
3-8 استخراج Total RNA35
3-9 Reverse Transcriptase (RT-PCR)36
3-9-1 طراحی پرایمرهای اختصاصی جهتReal-Time PCR36
3-9-2 Real-Time PCR (RT-qPCR)37
فصل چهارم: نتایج
4-1 استخراج Total RNA40
4-2 نتایج Real-Time PCR44
4-3 تایید پرایمرهای Real-Time PCR45
فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری
5-1 بحث48
5-2 محدودیت ها52
5-3 پیشنهادات52
فهرست منابع و مآخذ53
چکیده انگلیسی56
فهرست جداول
عنوان صفحه
جدول (3-1): دستورالعمل اجراییReal-Time PCR38
جدول(4-1 ) مقادیر OD600 ویبریوکلرا در هر 30 دقیقه و تعداد کلنی در واحد حجم40
جدول (4-2)مقادیر OD600 Shigella در هر 30 دقیقه و تعداد کلنی در واحد حجم42
جدول(4-3) مقادیر OD60 0E.Coli در هر 30 دقیقه و تعداد کلنی در واحد حجم فرمت43
جدول (4-4) میانگین نتایج44
جدول(4-5) میزان بیان ژنهای?-Red در باکتریهای dysentrieae Shigella,E.coli, Vibrio Cholerae46
فهرست اشکال
عنوان صفحه
شکل (1-1) عملکرد ژنهای exo, bet وgam بر روی DNA دو رشته ای5
شکل (1-2) نوترکیبی6
شکل (1-3) پروسه PCR9
شکل (1-4) منحنی PCR14
شکل (1-5) منحنی رشد باکتریایی22
شکل (4-1) منحنی رشد استاندارد Vibrio Choleraeدر طول 18 ساعت41
شکل (4-2) منحنی رشد استاندارد Shigellaدر طول 18 ساعت42
شکل (4-3) منحتی رشد استاندارد 0E.Coli در طول 18 ساعت43
شکل (4-4): کشت باکتری44
شکل(4-5) میزان غلظت و خلوص RNA total بوسیله دستگاه نانودراپ45
شکل (4-6) PCR باند های مربوط به dnaE و ?-Red 46
چکیده
نوترکیبی همسان فرایندی است که در آن میتوان به تحریک ژنهای خاصی اقدام نمود که در نهایت با عملکرد جدید این ژنها میتوان یک ارگانیسم را به تولید یا عدم تولید یک پروتئین خاص وادار نمود. در حال حاضر تحقیقات گوناگونی وجود دارد که در آنها از نوترکیببی همسان استفاده میشود. هرچقدر این روشها بهینهتر گردند، مسلما فرایندهای اقدامات آزمایشگاهی را تسهیل خواهد نمود، در نوترکیبی همسان قطعه ای از محصول PCR به داخل کروموزوم باکتری وارد شده و با استفاده از وکتورهای ?-Red قادرخواهیم بود که ژن recA را در میزبان تحریک کرده ونوترکیبی همسان را به انجام برسانیم. درمطالعات قبلی نشان داده شده است که طول توالیهای انتهایی (flank) دو سر انتهای محصولPCR نقش مهمی در انجام نوترکیبی همسان دارد، ولی انتخاب طول flank طبق قاعده و قانون خاصی نیست و محقق باید بصورت آزمون و خطا این طول را انتخاب نماید. در مطالعات انجام شده بر سویه های استاندارد، طول این flank میتواند از 50 تا 2000 جفت باز متغیر می باشد.
در این مطالعه ابتدا باکتری های استاندارد dysentrieae Shigella,E.coli, Vibrio Cholerae در محیط غذایی کشت داده میشود و سپس کلنی مساوی از هر یک از باکتری ها را انتخاب و جهت استخراج totalRNA به کار میرود. پس از تهیه total RNA آن را تبدیل به total cDNA می کنیم،. جهت تعیین وارزیابی بیان ژن ?-Red از تکنیک Real-timePCR با استفاده از SYBR green? و روش Relative استفاده نموده و میزان بیان ژنهای ?-Red را در هر میزبان به دست خواهد داد. ژنهای ?-Red ومیزان بیان آن در میزبان های متفاوت متغیر بوده و قطعا با ارزیابی بیان آن
می توان تا حدود زیادی طول مناسب را جهت نوترکیبی همسان تعیین کرد. در آن پایان نامه تلاش میگردد تا فرایند انجام نوترکیبی همسان در سویه های باکتری dysentrieae Shigella,E.coli, Vibrio Cholerae را تسهیل نمود. به عبارتی قرار است بررسی گردد آیا نتایج بدست آمده باعث کمک به بهبود فرایند نوترکیبی همسان میشود یا خیر؟ و واضح است که هر چه میزان بیان ژنهای ?-Red بیشتر باشد، بازده نوترکیبی همسان با طول کمتر flank نیز میسرتر است.
واژگان کلیدی: نوترکیبی همولوگ، ژن ?-Red، dysentrieae Shigella,E.coli, Vibrio Cholerae

فصل اول
مقدمه

1-1 انتقال ژن در باکتری
در اکثر باکتری ها توراث ژنها اغلب به صورت عمودی است اما قسمت قابل توجهی از آن توسط انتقال جانبی یا عرضی بین باکتری ها انتقال می یابد. عناصر ژنتیکی متحرک مثل پلاسمیدها، باکتریوفاژها و ترانسپوزون ها به همراه تغییرات ژنی مثل حذف، اضافه شدن و ترتیب دوباره ژن ها سیر تکاملی پروکاریوتها را تسریع کرده اند و باعث ایجاد تغییرات در ژنوم باکتری ها و در نتیجه ایجاد تنوع ژنتیکی گردیده اند. باکتری ها با توجه به داشتن ژنوم کوچکتر نسبت به یوکاریوتها توانایی بیشتری برای به
اشتراک گذاشتن ژنومشان از طریق انتقال عرضی ژن توسط هم یوغی، ترانسداکشن1 و ترانسفورمیشن2 دارند. مهمترین فرآیند هم یوغی است که طی تمـاس مستقیـم سلول با سلول اتفاق میافتد
(Proter 1997; Burrus 2006).
هم یوغی امکان تغیرات ژنتیکی بین باکتریها و گاه حتی بین سلولهای یوکاریوتی را امکان پذیر
می سازد و اغلب توسط آن ژن های موجود بر روی ” پلاسمیدهای کانژوگه” منتقل می شوند. ترانسداکشن نوع دیگری از انتقال افقی ژن است که توسط ویروس ها و باکتریوفاژها صورت می پذیرد. بعضی از باکتریوفاژها می توانند به صورت یک پروفاژ به داخل کروموزوم باکتری میزبان وارد شده و باعث لیزوژنی آن شوند. پروفاژها قسمت مهمی از اکتساب افقی ژن را در DNA بسیاری از باکتریها به خود اختصاص داده اند. گاهی اوقات باکتریوفاژها باعث انتقال قسمت های متحرک دیگری از DNA باکتری و یا قسمتی دیگر از DNA ثابت باکتری می شوند و این زمانی اتفاق می افتد که خروج فاژ به صورت دقیق صورت نگیرد. این مرحله ترانسداکشن تخصصی 3 نامیده می شود.
سومین نحوه انتقال ترانسفورمیشن است که در آن DNA آزاد از محیط برداشته میشود. برای پایدار ماندن DNA وارد شده به ژنوم میزبان طی هر سه روش احتیاج به یک سری مراحل حمایت کننده مثل نوترکیبی یکسان4 می باشد. همگان قبول دارند که اکتساب توالی های جدید و توسعه ژنوم امری حیاتی برای تکامل میباشند. این که آیا ژن های اکتسابی در باکتری نگه داشته می شوند و یا این که چگونه باقی
می مانند بستگی به عملکرد آن ژنها و فشار انتخابی محیط برای نگه داشتن آن دارد .( Proter 1997)

1-2 ترانسفورماسیون
ترانسفورماسیون یکی از راههای انتقال توارث به سایر باکتریها میباشد. در این روش یک تکه DNA دو رشته ای آزاد در محیط به سطح یک باکتری دیگر متصل شده و تنها یک رشته آن وارد باکتری شده و در کروموزوم باکتری میزبان ادغام می شود. برای داخل شدن قطعه ای از DNA در درون کروموزوم، عملکرد اپرون UVrABCD (UV در اول اسم اپرون مخفف پرتو UVاست ) ژن rec A بر اثر عوامل مثل uv ، عوامل شیمیایی و ورود DNA تک رشته ای به درون باکتری فعال میشود و rABCD مخفف ژنهایrecA, recB, recC و recD میباشد) این اپرون شامل ژنهای recA, recB, recC وrecD میباشد. فرآیند نوترکیبی5 بواسطه پروتئین RecA فعال میگردد. در این فرآیند، اگر DNAتک رشته ای وارد شده در باکتری، با ناحیه ای از کروموزوم تشابه داشته باشد، تعویض میگردد که این جابجایی بواسطه پروتئین RecA انجام
می پذیرد. از طرفی ژنهایrecB, recC وrecD نقش تنظیمی، با عملکرد منفی بر روی ژن recA را بازی میکنند(Hamood et al., 1986).
در حال حاضر، در آزمایشگاههای تحقیقاتی، با استفاده از این سیستم و نحوه ادغام فاژ ? وکتوری (وکتور ها مولکول‌های DNA ای هستند که برای کلون کردن قطعات DNA در سلول های میزبان به کار می‌روند) را تولید نموده اند که میزان نوترکیبی را در باکتریها افزایش میدهند. در این وکتور سه ژن exo, bet وgam را تحت یک پروموتری که با L-arabinose تحریک می شود قرار داده اند. عملکرد این سه ژن بدین صورت است که پروتئین Exo باعث هضم نوکلئوتیدها از قسمت 5′ انتهای DNA دو رشته ای
میشود و پروتئین Bet با حفاظت از قسمت تک رشته ای 3′ بوجود آمده، مانع تخریب آن میگردد. نهایتا پروتئین Gam با ممانعت از عملکرد ژنهای recB,recC وrecD باعث تحریک بیان ژن recA در باکتریها می شود (شکل1-1).
مارکر مقاومت آنتی بیوتیکی در این وکتور آمپی سیلین بوده و از نظر تعداد پلاسمید در باکتریها، جزء پلاسمیدهای شمارش تکرار پایین6محسوب میگردد. بهترین دما، برای تکثیر این وکتور 30 درجه سانتیگراد بوده و در دمای 42-37 درجه سانتیگراد از دست میرود. بنابراین از این نظر، جزء پلاسمیدهای حساس به دما7 نیز تقسیمبندی میگردد (Yamamoto et al., 2009). مهمترین و کاربردی ترین پلاسمید در این زمینه pKD46 بوده که قابلیت تکثیر، در dysentrieae Shigella,E.coli, Vibrio Cholerae را دارد.

شکل (1-1) عملکرد ژنهای exo, bet وgam بر روی DNA دو رشته ای

1-3 نوترکیبی
نوترکیبی8 ژنتیکی فرآیندی است؛ که طی آن مولکول اسیدنوکلئیک شکسته شده و به شکلهای مختلف به یکدیگر متصل می شوند. این عمل در بیشتر مواقع مربوط به DNA و گاهی درRNA نیز دیده
می شود. نوترکیبی می تواند بین کروموزوم های همولوگ باشد که به آن نوترکیبی همسان گفته می شود. نوترکیبی به طور معمول روشی برای ترمیم DNA پروکاریوت و یوکاریوت ها می باشد که در یوکاریوت ها در میوز رخ داده و به آن فرآیند کراسینگ اور می گویند. در طی آن جابه جایی کروموزوم پدر و مادری رخ می دهد و می‌تواند سبب تولید الل جدید شود. در سیستم ایمنی این فرآیند نقش بسیار مهمی را ایفا میکند وسبب مقاومت بدن در مقابل بیماریزاهای مختلف می شود.

شکل( 1-2) نوترکیبی

نوترکیبی روشی مفید در مهندسی ژنتیک محسوب می شود. از نوترکیبی می توان جهت ایجاد تغییر در نوکلئوتیدهای ژنوم باکتری ها، ویروس ها،BACs9،10PAC و پلاسمیدها استفاده کرد. ولی لازم به ذکر است که نوترکیبی در محیط زنده11 نیز انجام می پذیرد. بنابراین برای ایجاد چنین تغییری در ژنوم می توان از نوترکیبی همسان12 استفاده کرد. در نوترکیبی همسان باید از محصول PCR13 که انتهاهای آن به صورت تک رشتهای در آمده و یا از تک رشته های DNAسنتتیک استفاده نمود. در پروکاریوت ها میزان ایجاد نوترکیبی طبیعی 10-5-10-4 میباشد ولی میزان ایجاد نوترکیبی همسان 10-1/0 درصد می باشد. در نوترکیبی همسان مهمترین فاکتور طول قسمتهای انتهایی محصول PCR می باشد که به خاطر عملکرد محصول ژن bet صورت تک رشته ای در آمده است. هر چه میزان طول ترادف های همسان بیشتر باشد بازده ی نوترکیبی همسان بیشتر خواهد بود. پدیده ی نوترکیبی همسان به واسطه ی بیان ژنrecA در باکتری ها صورت
می گیرد. بنابراین هر چه میزان بیان ژن recAبیشتر باشد بازدهی نوترکیبی همسان نیز بیشتر خواهد بود (Sharan et al.,2009). نوترکیبی همسان در باکتریها بواسطه ی حضور پر رنگ بیان ژن recA صورت
می گیرد.
بیان ژن recAبواسطه ی اپرون recBCD. (اپرون واحد عملکرد DNAژنومی است که شامل مجموعه‌ای از ژن‌های تحت کنترل یک سیگنال نظارتی یا پروموتر است) کنترل و سرکوب میگردد تا از بیان افسار گسیخته ی آن جلوگیری شود. کاهش بیان ژن recA باعث کاهش میزان نوترکیبی می گردد. در نتیجه برای افزایش بازدهی آن به تحریک بیان ژن recA به عنوان کلید حل این معما استفاده کرد
(Murphy et al., 2000).
سیستم نوترکیبی مبتنی بر ?-Red در تغییر ژن ها بسیار سودمند میباشد. شیوه های ساده ای برای غیر فعال سازی و تغییر ژنها و نوکلئوتیدها در باکتریها با استفاده از تکنیک بازسازی ژنتیکی سلول وجود دارد، این امر با کمک سیستم نوترکیبی ?-Red و محصول PCR حامل یک کاست مقاومت انتی بیوتیکی روی کروموزوم باکتری صورت می گیرد و هر چه طول انتهای همولوگ بیشتر باشد، بازدهی نوترکیبی همسان بیشتر خواهد بود (Yamamoto et al., 2009).
نوترکیبی همولوگ در ترمیم DNAآسیب دیده در حین همانندسازی DNA موثر است. در سلولهای یوکاریوتیک میزان نوترکیبی همسان 8-16 درصد گزارش شده است(Saleh Gohari et al., 2005). مطالعات نشان داد که نوترکیبی همسان در باکتری , Vibrio Choleraeباعث ایجاد سویه های زنده ضعیف شده می گردد. ژنهای mer،ctxB،hlyA بواسطه نوترکیبی همسان دگرگون شده و باکتری های وحشی تبدیل به سویه های کاربردیCVD109 گردیدند. در این پروسه توالیهای یکسان انتهایی با طولهای متفاوت 100،500،1000 نوکلئوتیدی بررسی شده (Michalski et al.,1993). نهایتا مقالات و گزارشات نشان می دهد که هر چه میزان بیان ژن recA بیشتر باشد، بازدهی نوترکیبی همسان نیز بیشتر خواهد بود. ولی نکته مهم این است که میزان بیان ژن recA در باکتری های متفاوت نیزاختلاف نسبتا جزئی دارد، بنابراین ارزیابی و سنجش بیان ژن recA در بهبود و افزایش بازدهی نوترکیبی همسان مفید واقع خواهد شد و برهمگان واضح است که فرایند نوترکیبی همسان برای ایجاد واکسن و سویه های زنده ضعیف شده و همچنین ارزیابی ژنهای کنترلی مفید خواهد بود.

1-4 تعریف PCR14
این تکنیک در اواسط دههی 1980 بوسیله ی کری مولیس معرفی شد. به دلیل کاربردها و مزیتهای بسیار زیاد آن به سرعت در زیست شناسی مولکولی گسترش پیدا کرد. امروزه این روش تقریباً در تمامی آزمایشگاهها ی زیست مولکولی جزو کارهای متداول می باشد و به صورت اتوماتیک بوسیلهی کامپیوتر انجام می شود.این تکنیک تمامی مشکلات قبلی در زیست مولکولی که ناشی از عدم دسترسی به مقادیر زیاد از DNA یکسان بود را برطرف کرد. برای مثال قبلاً برای بدست آوردن نسخههای متعدد از یک ژن خاص می بایست این ژن را به داخل حامل مناسب وارد کرده و در یک باکتری تکثیر کنند ولی امروزه این کار را به سادگی و با استفاده از PCRانجام می دهند. PCR به معنی واکنش زنجیره ای پلی مراز می باشد. هدف از آن سنتز رشته هایDNA جدید از روی رشته های الگو است که به صورت زنجیر وار تکرار
میشود. PCR دارای انواع متعددی می باشد که یکی از آنها Real TimePCRاست. دراین روش از ژل آگارز استفاده نمی شود و امروزه با دستگاه های به نام لایت سایکلر15 که مقدار محصول در هر سیکل را نمایش می دهد بسیار ساده شده است. در ساده ترین حالت از اتیدیوم بروماید16 به عنوان رنگ تداخلی با DNA برای تعیین مقدار محصو ل تولید شده در هرسیکل می توان استفاده کرد. ازآنجایی که قابلیت فلورسانس اتیدیوم بروماید در حضور DNA دورشته ای افزایش می یابد، می توان از آن برای تشخیص وتعیین مقدارمحصول دورشته ای استفاده کرد. اتیدیوم بروماید تقریبا هیچ گونه اثری برروی مقدارو خصوصیات واکنش های PCR، ندارد بنابراین تکثیر توالی های خاص DNA وتشخیص همزمان آن با دستگاه ترانس ایلومیناتور فرابنفش17 امکان پذیر می گردد.
PCR از نظر اصول عملی تشابه زیادی به همانند سازی DNA دارد و در واقع برگرفته از آن است . یاد آوری می شود که DNA پلیمراز DNA تک رشته ای را از جهت 5َ به 3َ به عنوان الگو مورد استفاده قرار می دهد ورشته مکمل را در جهت5َبه 3َمی سازد. همچنین DNA پلیمراز برای شروع احتیاج به یک قطعه اولیه (شناساگر) دارد.
برای انجام PCR ، DNAپلیمراز ، نوکلئوتید تری فسفات ها و پرایمر لازم هستند. از آنجائیکه DNA دو رشته ای است، دو نوع پرایمر درPCR موردنیاز است. این دو پرایمر دو عمل انجام می دهند، اول اینکه محل ژنی که باید تکثیر شود را مشخص می نمایند و دوم اینکه اندازه ی قطعات تکثیر شونده را تعیین
می کنند . عمل اول کاملاَ مشخص است، در مورد عمل دوم باید گفت که وقتی این دو شناساگر به دو ناحیهی مختلف DNA و به سمت هم قرار میگیرند DNA پلیمراز تنها قطعات را در بین این دو ناحیه همانندسازی میکند و به این ترتیب طول قطعات ساخته شده تعیین میشود. برای شروع PCR ، DNA الگو، پرایمر ها و نوکلئوتید تری فسفات ها و DNA پلیمراز در یک لوله با هم مخلوط می شوند. سپس لوله را گرم می کنند تا دو رشته DNA از هم جدا شوند. سپس لوله را سرد می کنند تا پرایمر ها به نواحی مورد نظر متصل شوند و DNA پلیمراز شروع به همانند سازی از روی DNA بنماید. بعد از مدت زمان لازم برای همانند سازی بار دیگر پرایمرها به نواحی مکمل خود متصل شوند. چون در مرحله ی قبل رشته DNA در ناحیه مورد نظر مضاعف شده است، در این مرحله چهار رشته ی الگو برای همانند سازی وجود دارد و در نتیجه در پایان این مرحله بوجود می آید، و در مرحله ی بعد 16 نسخه و به همین صورت بطور تصاعدی تعداد نسخه های ژن ها زیاد می شود .
در ابتدای طراحی PCR از آنزیم DNA پلیمراز E.coli استفاده شد ولی این آنزیم به حرارت حساس می باشد و بنابراین پس از هر بار حرارت دادن محیط واکنش تا دمای 94 درجهی سانتیگراد، افزودن دوبارهی آنزیم تازه به محیط لازم بود. یکی از مهمترین کشفیات در این زمینه این بود که باکتریهای
چشمههای آب گرم دارای DNA پلیمراز هایی هستند که نسبت به حرارت مقاوم بوده و حتی در دمای بالا فعالیت بهتری دارند . برای مثال باکتری Thermus aquaticus دارای DNA پلیمرازی است که در دمای 94 درجه ی سانتی گراد کاملاَ پایدار است و همچنین دمای اپتیمم عمل آن نیز 72 درجه ی سانتی گراد می باشد، این DNA پلیمراز که بطور خلاصه Taq پلیمراز نامیده می شود باعث شد که براحتی PCR به صورت اتوماتیک انجام شود و با افزودن یکبار آنزیم Taq پلیمراز دیگر نیازی به اضافه کردن مجدد آن نباشد .
مزیت بسیار مهم دیگر Taq پلیمراز افزایش حساسیت و دقت PCR می باشد. در دمای پایین
(30 درجه سانتیگراد) (که برای DNA پلیمراز E.coli بکار میرفت) پرایمرها ممکن است به جایگاههایی که توالی تا حدودی مشابه دارند نیز متصل شوند، زیرا در دمای پایین تعداد کمتری پیوند هیدروژنی برای اتصال پرایمرها نیاز است. بنابراین پرایمرها با اتصال به نواحی نسبتاَ مشابه، باعث ایجاد اشتباه در انجام مراحل PCR میشوند. ولی وقتی که واکنش در دمای 72 درجه (دمای اپتیمم فعالیت Taq پلیمراز) انجام شود اتصال پرایمر ها به نواحی غیر از ناحِیهی اصلی کاهش مییابد. به این صورت پس از پایان PCR
رشته های DNA کاملاَ مشابه و خالص بدست خواهد آمد. برای دیدن قطعات تکثیر شده DNA میتوان براحتی از الکتروفورز برای ژل آگاروز و رنگ امیزی اتیدیوم بروماید استفاده کرد .

شکل(1-3) پروسه PCR

1-4-1 کاربردهای PCR :
تکنیک PCR کاربردهای نا محدودی در عرصه های مختلف زیست مولکولی دارد ، علت اصلی این امر این است که DNA الگوی بکار رفته در PCR را میتوان از منابع مختلف تامین کرده و مورد استفاده قرار داد. بطور کلی PCR به منظور تهیه ی نسخه های متعدد از یک ژن و بررسی حضور یا عدم حضور یک ژن خاص در یک قطعه DNA بکار می رود .

1-4-2 تهیهی نسخه های متعدد از یک ژن
برای این کار بجای اینکه هر دو پرایمر مورد نیاز برای PCR را به یک میزان به محیط واکنش اضافه کنند، یکی از پرایمرها را به تعداد کمتر پرایمر دیگر را به تعداد بیشتر اضافه می کنند. در هنگام انجام PCR، در ابتدا هر دو رشته با هم همانند سازی می کنند ولی پس از تمام شدن یکی از پرایمر ها فقط رشته دیگر که هنوز پرایمر آن وجود دارد ساخته می شود و به همین دلیل نسخه های بیشتری از این رشته بوجود
می آید. پس از پایان PCR چند نسخه DNA دو رشته ای از ژن مورد نظر ایجاد خواهد. مثال دیگری از کاربردهایPCR بررسی پیوستگی ژنها و تعیین فاصله ی بین ژنها بر روی کروموزومهای انسان است. در ژنتیک برای تعیین فاصله ی بین ژنها از بررسی تعداد نوترکیبها به نسبت فنوتیپ والدین استفاده می شود. این روش برای مگس سرکه که زادآوری آن در هر نسل بسیار زیاد و دوره ی رشد آن نیز کوتاه است به راحتی قابل انجام است ولی در مورد انسان که زاده های آن در هر نسل بسیار محدود و با فاصله ی زمانی زیاد می باشد، این بررسی هابه سختی و با محدودیت بسیار انجام می گیرد. ولی امروزه دانشمندان با استفاده از PCR روش جدیدی را برای این کار پیدا کرده اند.

1-4-3 مراحل آزمایشگاهی PCR:
1- واسرشت سازی دو رشته DNA: دراین مرحله DNA دو رشته ای در درجه حرارت بالا(حدود ?? درجه) به منظور به دست اوردن مولکول های DNA تک رشته ای، واسرشت می شود.
?- هیبریداسیون: در این مرحله توسط پرایمرهای الیگونوکلئوتیدی که مکمل توالی DNA تک
رشتهای شده هدف می باشند در درجه حرارت حدود ?? تا ?? درجه هیبریداسیون صورت می گیرد.
?- طویل سازی (بسط یا سنتز): در این مرحله با یک DNA پلیمراز مقاوم به حرارت مانند Taq پلیمر از در درجه حرارت حدود ?? درجه سانتیگراد طویل سازی رشته صورت می پذیرد.
این مراحل پیدرپی تکرار می شوند به طوری که تعداد قطعات DNA در هر سیکل دو برابر میشوند.به قطعاتی که در هر سیکل به صورت تصاعدی افزایش می یابند آمپلیکون18 می گویند.

1-5 Real-Time PCR ‏
به علت ورود نسل جدیدی از ترموسایکلرها با سیستم فلورومتری که اجازه پایش پیوسته خاصیت فلوئورسانس محصول ‏PCR‏ در زمان جمع شدن را می‌دهد، این روش ابداع شد. در این روش از کاوشگرهایا پروب‌های هیبریداسیون نشان‌دار شده با رنگ‌های فلورسانس در انتهای ّ5 یا ّ3 استفاده می‌شود. که امکان پایش پیوسته محصول ‏PCR‏ را بدون جداسازی آنها در روش‌ها یا الکتروفورز در ژل آگاروز یا ژل پلی آکریل آمید می‌دهد. این سیستم در سال 1992 کشف شد.در این روش به دلیل کاهش زمان سیکل‌های ‏PCR، سرعت کار نسبت به سیستم ‏PCR‏ معمولی بیشتر است.
سازندگان و کاربران این روش سعی می‌کنندمحصول ‏PCR‏ کوچک‌تر طراحی کنند تا سرعت افزایش یابد اما تجربه نشان داده که کاهش اندازه محصول لزوماً بازده ‏PCR‏ را بهینه نمی‌کند. البته این روش دارای معایبی نیزاست از جمله می‌توان به عدم ناتوانی در مشخص کردن اندازه محصول بدون باز کردن سیستم و ناسازگار بودن برخی پلت فرم‌ها با شیمی برخی رنگ‌های فلورژنیک اشاره کرد. برای شناسایی بسیاری از ویروس‌های عامل بیماری‌های انسان از این روش استفاده شده است. درReal Time PCR میزان محصول در هر چرخه قابل ردیابی است و امکان بررسی و آنالیز چند رونوشت متفاوت در یک تیوپ امکانپذیر است. حساسیت و دامن? دینامیکی آن 1000 برابرPCR است؛ به کمک این تکنیک می‌توان ارزش گذاری کمی انجام داده و میزان الگوی اولیه را دقیقاً تخمین زد. تفاوت Real Time PCR با PCR معمولی در این است کهReal Time PCR توانایی تشخیص در مراحل اولیه واکنش یعنی مرحله نمایی را دارد در حالی که در روش PCR معمولی از ژل الکتروفورز در مراحل پایانی یعنی مرحله پلائو واکنش استفاده می شود.

1-5-1 کاربردهای Real Time PCR
1- تحقیقات در مورد میزان بیان .mRNA?- اندازهگیری میزان همانندسازی DNA در ژنوم یا DNA های ویروسی. ?- میزان تأثیر دارو درمانی. ?- سنجش آسیبهای DNA 5- تشخیص عوامل بیماریزا. ?- تعیین ژنوتیپ افراد. ?-سنجش تفکیک شدن آللی.

1-5-2 اصول کارReal Time PCR
تمامی اصول و واکنش‌گرهایی که برای یکRT-PCR معمولی نیاز است دراین تکنیک هم بکار می‌رود اما یک گزارشگر فلورسنت نیز در واکنش حضور دارد. این گزارشگرها به گونه‌ای طراحی می‌شوند که در صورت تکثیر DNA نور تولید کنند. لذا افزایش شدت نور ثبت شده در دستگاه با میزان محصول بدست آمده نسبت مستقیم دارد. با ادامه یافتن PCR شدت فلورسنت رو به افزایش می‌گذارد. به اولین چرخه‌ای که شدت فلورسنت بیشتر از خط پایه باشد چرخ? آستانه گویند. عدد CT با مقدار الگوی اولیه رابط? معنی‌دار دارد و از روی آن می‌توان مقدار mRNA اولیه را تخمین زد. به عبارت دیگر در فاز اولیه مرحله تصاعدی مقدار فلورسنت افزایش می یابد تا به آستانهای می رسد که به مقدار مشخصی از سطح background بالاتر است، این چرخه (سیکلی از PCR که قطعه تکثیر از حد آستانه عبور می کند) به عنوان CTشناخته می شود که دربرخی منابع با عنوان Crossing Point مطرح شده است. این مرحله شروع نسخه برداری از قالب است که در محاسبات نتایج آزمایش استفاده میشود.

1-5-3روش کار Real Time PCR
در این روش از یک مولکول گزارشگر19 فلوروسنت برای مشاهده پیشرفت PCR به کار میرود. فلوروسنت از مولکول گزارشگر ساطع میشود که تولیدات را چند برابر میکند. بر مبنای ملکولی که برای تشخیص استفاده میشود. در تشخیص غیر اختصاصی با استفاده از رنگهای باند شده بهDNA به عنوان گزارشگر فلوروسنت برای مشاهده واکنش PCR استفاده میشود. این فلوروسنت در سیکل متوالی بر اثر مضاعف شدن افزایش می یابد. با ثبت مقدار فلوروسنت ساطع شده در سیکل، می توان واکنش را در طول مرحله نمایی مشاهده نمود. اگر نموداری میان لگاریتم مقدار شروع واکنش و افزایش فلوروسنت گزارشگر ترسیم شود یک رابطه خطی مشاهده خواهد شد. اغلب از SYBRGreen به همراه DNA دو رشته ای به عنوان رنگ مخصوص گزارشگر استفاده می شود. این رنگ به شکاف کوچک از مارپیچ دو رشته ای DNA باند می شود. در داخل محلول, رنگهایی که باند نشده اند فلوروسنت خیلی کمی را نشان میدهند و فلوروسنت زمانی به وضوح افزایش میبابد که رنگ به DNA دو رشته ای پیوسته شود. SYBRGreen تحت شرایط PCR پایدار وبا ثبات باقی می ماند. سطح مطلوبی از درجه حرارت موجب تنظیم القاء و نشر طول موج ها می شود. همان طور که پیشتر ذکر شد از اتیدیوم بروماید نیز برای تشخیص می توان استفاده کرد ولی به علت سرطان زا بودن ان کمتر استفاده می شود.
در طراحی پرایمر، نکاتی جهت انجام واکنش Real-Time PCR در نظر گرفته شد که شامل:
– طول محصول 200-75باز
– اختلاف Tm در هر دوجفت پرایمر حداکثر 5/0 درجه سانتیگراد باشد.
– داشتن خصوصیات لازم در سایر پرایمرهای معمولی

1-5-4 آنالیزهای کمی در Real time PCR
دو روش عمده برای بررسی کمی در Real time PCR وجود دارد

1-5-5 روش منحنی استاندارد(مقایسه مطلق)
در این روش از نمونه RNA یا DNA با غلظت مشخص برای رسم منحنی استاندارد استفاده
می شود. غلظت RNA یا DNA استاندارد با اسپکتروفوتومتر (260nm) تعیین میشود و سپس از روی وزن مولکولی نمونه به تعداد نسخه های آن تبدیل می شود.استانداردهای غلظتی ژنهای معروف به صورت تجاری قابل خریداری است.
برای حذف نوسانات مقادیر RNA وارد شده در واکنش و خطاهای عملکرد دستگاه ها و فرد از استاندارد های داخلی استفاده می شود.به این ژن ها Housekeeping گویند. علاوه بر برپایی PCR با پرایمر اختصاصی ژن برای هر نمونه یک PCR همزمان با پرایمر بتااکتین یا GAPDH هم انجام می شود و دادههای هر نمونه با ژن Housekeeping همان نمونه نرمالیز می شود. سپس با استفاده از نمونه استاندارد
می توان به نمونه مجهول پی برد.

1-5-6 روش آستانه نسبی(مقایسه نسبی)
در این روش نیازی به رسم منحنی استاندارد نیست. و مقدار نرمالیز شدهCT نسبت به یک نمونه تیمار نشده سنجیده می شود. در این روش نیز به استاندارد های داخلی نیازمندیم.و باید مقدار CT آن ها از مقدار CT نمونه مورد نظر کسر گردد (نرمالیز کردن).
تفاوت نسبی نمونه آزمایش در مقابل کنترل محاسبه می شود.
CT عبارتست از C ژن هدف (کالیبراتور) که از C ژن Housekeepin کسر شده است.

شکل( 1-4) منحنی PCR

1-6E.coli
Escherichia coli که بطور اختصار E.coli نیز نامیده می‌شود، نوعی باسیل گرم منفی از خانواده انتروباکتریاسه‌است که بطور شایع در روده جانوران خونگرم وجود دارد. بیشتر سویه‌های E.coli، بی‌آزار هستند اما برخی از سروتیپ‌ها موجب مسمویت غذایی و اسهال می‌شوند(مرکز جهان20CDC). این سویه‌های بی‌آزار، بخشی از فلور عادی روده هستند. آن‌ها در تولید ویتامین K وB نقش دارند و از استقرار باکتری‌های بیماریزا در روده جلوگیری می‌کنند. این باکتری، 1/0% فلور روده را به خود اختصاص داده‌است. این باکتری از طریق مسیر مدفوعی-دهانی21‏ از یک فرد به فرد دیگر منتقل می‌شود.

1-6-1 خصوصیات عمومی
هر گرم از مدفوع انسان حاوی بیش از 108 باکتری E.coli می باشد.c. E.coli به خوبی روی محیط های خیلی ساده رشد می کند، و متحرک می باشد. لاکتوز را تخمیر می کند و درخشندگی سبزرنگی روی محیط EMB(جلای فلزی) تشکیل می دهد.
این باکتری دارای فعالیت لیزین دکربوکسیلاز22بوده و می تواند استات را به عنوان تنها منبع کربن استفاده نماید و قادر به هیدرولیز تریپتوفان می باشد. این باکتری23MUG مثبت است. این باکتری پس از 10 دقیقه در 70°C از بین می رود. نسبت به مقادیر زیاد املاح صفراوی ـ سلینت F حساس است. رنگ های مالاشیت گرین و بریلیانت گرین از رشد این باکتری جلوگیری کرده و از این مواد برای تهیه محیط های انتخابی پاتوژن ها استفاده می گردد. E.coli به عنوان یک پاتوژن کلیدی در عفونت های بیمارستانی مطرح است و هم چنین عامل ایجاد کننده عفونت های مجاری ادارای کسب شده از جامعه نیز می باشد.

1-6-2 تقسیم‌های دوتایی و پیاپی E.coli
E.coli، باسیل گرم منفی، متحرک و بی‌هوازی اختیاری و بدون اسپور است. این باکتری در شرایط بی‌هوازی، مخلوطی از اسیدها مانند لاکتات، سوکسینات، اتانول، استات و دی اکسید کربن را تولید می‌کند رشد بهینه باکتری در دمای ?? درجه سانتی‌گراد است اما تا دمای ?? درجه را نیز تحمل کرده و به رشد خود ادامه می‌دهند (Fotadar et al., 2005).E.coli، هم در شرایط هوازی و هم بی‌هوازی می‌تواند رشد کند. سویه‌ها دارای تاژک هستند و به خاطر همین، متحرک هستند. تاژه‌ها متعدد و از نوع پیرامونی24 ‏هستند (Darnton et al., 2007). E.coli و باکتری‌های مشابه آن، با استفاده از مکانیسم‌هایی مانند ترانسفورماسیون، هم یوغی(کانژوگاسیون) و ترانسداکسیون، ماده ژنتیکی خود را از راه انتقال افقی ژن‌ها به سایر باکتری‌های مشابه خود منتقل می‌کنند. به عنوان مثال، انتقال ژن توکسین شیگا از ShigellaبهE.coli O157:H7 از طریق فاژ (ترانسداکسیون) اتفاق افتاده‌است (Brussow 2004).

دسته بندی : پایان نامه ها

پاسخ دهید